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生物资讯

关于慢病毒转导的那些事

作者:admin 来源:本站 发布时间: 2019-03-23 14:18  浏?#26469;?#25968;:
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慢病毒

 

利用病毒传递系统来转导细胞在基因和蛋白质研究已变得很常见,慢病毒载体就可以稳定地表达目的基因。

 

慢病毒,属于逆转录病毒,它的主要作用机制是表达逆转录酶,将病毒RNA转化为双链DNA,整合酶再将病毒DNA插入宿主DNA,然后和宿主细胞一起进行分裂。

 

慢病毒可以感染分裂细胞和非分裂细胞,如有丝分裂后的细胞。

 

 概述

 

 

我们都知道,病毒缺乏复制机制,所以需要细胞来“存活”。慢病毒载体传递系统最重要的一个方面就是慢病毒载体的生产,通常在HEK293细胞(或一些变种)。

 

例如,慢病毒传递系统的一个常见用途是插入短的发夹RNAs (shRNA),用于RNAi介导的基因敲除。

 

 



shRNA首?#32570;?#21253;装成慢病毒载体,然后转染HEK293细胞。转染的细胞孵育约3天,此间慢病毒复制和产生慢病毒颗粒,然后收获,评价滴度,再转化目标细胞。

 

 

 

 关于转染HEK293细胞

维持细胞的良好状态是必要的。HEK293细胞生长迅速,胰蛋白酶化速度快,所以不要在胰蛋白酶中长时间孵育,否则可能会有大量细胞死亡。

 

解冻后的细胞应至少传代两次,然后接种进行转导实验。并且要非常轻柔地处理,因为细胞很容易分离。

 

在转染实验中,HEK293细胞接种于约5*10^6细胞/10cm培养皿中,接种后?#31283;?#32454;胞约40-50%融合。

 

 为转导做好准备

将慢病毒载体质粒连同病毒包装载体打包成脂质体,并将其递送到HEK293细胞中。

 

在实验的包装部?#36136;?#29992;无血清培养基是非常重要的。无血清培养基促进DNA与阳离子脂质体复合物的形成,提高转染效率。

 

 



有了转染复合物,含shRNA、包装质粒和脂质体,就可以进行包装了。倾斜带有HEK293细胞的培养皿,将转染混合物逐渐加入收集的培养基中。

 

 



在添加转染混合物时要谨慎,温柔操作。一旦加入溶液,小心地旋转平板,使培养基混合,将转染混合物均匀地分配到细胞上。在无血清培养基?#20449;?#20859;5-8小时。

 

孵育后,轻轻抽吸培养基(这将包含没有转染HEK293细胞的含有质粒的脂质体),并在培养皿的一侧加入10 ml完全培养基,这样细胞就不会分离。HEK293细胞将shRNA包裹成病毒颗粒并释放到培养基中。 

 

此时,培养基中会充满病毒颗粒,因此在搬运时应穿戴?#23454;?#30340;防护用品。


48小时后收集培养基(病毒颗粒),将10 ml新鲜的完全培养基加入同一培养皿中。72小时后再次收集培养基,与48小时收集的结合。


通过0.45微米的过滤器对收集到的混合培养基进行消毒,以允许病毒通过。冻融循环会降低病毒的效力,所以最好进行分装。


病毒可以在4℃下保存一到两个月,长期保存在-20℃。经常使用漂白剂处理在病毒产生过程中使用的吸管头和平板。

 

 病毒进入细胞

通常,测定病毒的效价非常重要,方便确定实验浓度。一个良好的敲除,至少50%的细胞转导病毒。用?#23454;?#30340;分析方法检查细胞是否定点敲除,通常涉及到Western Blot。


1.使用相同比例的病毒和细胞获得50%的转导。在一个15ml的试管中,用5ml的完全培养基重悬约200万个细胞(10cm培养皿的四分之一)。

 

 



在同一试管中,加入2.5ml病毒和15ug/ml的聚凝胺。聚凝胺通过中和病毒颗粒和细胞膜之间的电荷来提高转导效率。

 

 

 



2.轻轻混匀,将细胞放入一个10cm的新培养皿中。24小时后,换到没有病毒的新鲜完全培养基中。

 

 



如果shRNA构建物含有荧光标记物,可以检测转染48小时后检测是否整合成功;如果没有,继续进行抗生素选择48小时。


 

  

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