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生物知识

详述细胞凋亡实验操作过程

作者:admin 来源:本站 发布时间: 2019-03-17 21:49  浏?#26469;?#25968;:
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简介 

 

细胞凋亡?#20405;?#20026;维持内环境稳定,由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同,细胞凋亡?#20405;?#21160;过程,它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用,是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。细胞凋亡和细胞增殖都是生命的基本现象,是维持体内细胞数量动态平衡的基本措施。

细胞凋亡的形态学特征

在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触,细胞变园,细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网和细胞膜进一步融合将细胞?#27542;?#22810;个完整包裹的凋亡小体,凋亡小体最后被吞噬细胞吞?#19978;?#21270;。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外,不会影响其它细胞,因而不引起炎症反应。

细胞凋亡的生物化学特征

在生物化学上,多数细胞凋亡的过程中,内源性核酸内切酶活化,活性增加。核DNA随机地在核小体的连接部位被酶切断,?#21040;?#20026;180-200bp或它的整倍数的各?#21046;?#26029;。如果对核DNA进行琼脂糖电泳,?#19978;?#31034;以180-200bp为基数的DNA ladder(梯状带纹)的特征。

细胞凋亡实验的原理

三尖杉酯碱对急性粒细胞白血病,急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明HT在0.02~5μg/ml范围内作用2小时,即可诱导HL-60细胞凋亡,并表?#27542;?#20856;型的凋亡特征。本实验用1μg/ml HT在体外诱导培养的HL-60细胞发生凋亡,同时也有少数细胞发生坏死。

凋亡细胞的鉴定方法

用Hoechst33342和碘化丙啶(propidium iodide,PI)对细胞进行双重染色,可以区别凋亡、坏死及正常细胞。

 

细胞膜是一选择性的生物膜,一般的生物染料如PI等不能穿过质膜。当细胞坏死时,质膜不完整,PI就进入细胞内部,它可嵌入到DNA或RNA中,使坏死细胞着色,凋亡细胞和活细胞不着色。而一些活细胞染料由于为亲脂性物质,可跨膜进入活细胞,因而可进行活细胞染色。Hoechst33342是一种活性荧光染料且毒性较弱,它是双苯并咪唑的一种衍生物。与DNA特异结合(主要结合于A-T)碱基区),显示凋亡细胞和活细胞。凡是看到有凋亡小体的细胞都是凋亡细胞。

实验用品

1、试剂:

三尖杉酯碱(HT),300μg/ml,100mmol/L Tris-HCl(pH7.5),5mol/L EDTA缓冲液、碱性裂解液:0.2mol/L NaOH, 1%SDS、醋酸钠:3mol/L KAc(pH4.8);异丙醇;70%乙醇;溴酚蓝,蔗?#20405;?#31034;剂。TBE电泳缓冲液,1%琼脂糖,溴乙锭。PI母液:500μg/ml;Ho33342母液:2mmol/L。 

2、仪器设备:

荧光显微镜,电泳仪,电泳槽,微量加样器(1ml,100μl)0.5、1.5ml离心管,载玻片,盖玻片。

3.实验材料:

人早幼粒白血病HL-60细胞,用含10%小牛血清的RPMI1640培养基在37℃,5%CO2条件下培养。

实验过程

1.三尖杉酯碱诱发HL-60细胞凋亡
(1)实验前约24小时,接种两瓶HL-60细胞,标记①、②,每瓶含约6ml培养液,置37℃,5%CO2培养箱培养。
(2)实验前约2.5小时,当细胞密度达到70%,①号瓶加入三尖杉酯碱200μl,使终浓度为1μg/ml,②号瓶中加入同等量PBS(pH7.4)作对照。共同放入培养箱中继续培养2.5小时。

2.Ho33342和PI双重染色鉴别三种细胞
(1)染色:将瓶中的细胞摇匀取200μl于1.5ml的离心管中,加入Ho33342母液2μl,PI 20μl,染色15?#31181;印?/span>
(2)滴片:取一载玻片用双面胶围成一小室,从离心管中各取以上染色后的细胞悬液10μl,加入小室内盖?#32454;?#29627;片,荧光镜下用紫外激发光,高倍镜下观察,区别三种细胞,并注意三者比例

注意事项

1、诱导培养HL-60细胞时间要准确;
2、荧光显微镜下观察细胞时,由于荧光易碎灭,观察时要尽量快


——本文部分内容选自互联网

 

 

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